Techniki biologii molekularnej 2100-TBMBIOT-2-S1

WYKŁAD: Wektory do klonowania – plazmidy, wektory lambdowe, kosmidy, PACi, BACi, YACi, wektory roślinne. Źródła DNA do klonowania – cDNA, DNA genomowe, DNA namnożone metodą PCR. Metody przygotowania zgodnych końców wektora i DNA do klonowania za pomocą enzymów restrykcyjnych, terminalnej transferazy, doligowania adapterów i ich restrykcji. Ligacja. Zapobieganie samoligacji wektora. Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do komórek gospodarza. Selekcja poszukiwanego klonu – metody hybrydyzacyjne, immunodetekcyjne, funkcjonalne i w oparciu o PCR. Molekularna hybrydyzacja – znaczniki molekularne, metody znakowania kwasów nukleinowych na całej długości, na końcu 5’ lub 3’. Rygorystyczność hybrydyzacji. Hybrydyzacja Southerna. Hybrydyzacje dot/slot blot. ASO - hybrydyzacja allelo specyficznego oligonukleotydu. Hybrydyzacja zoo. RFLP. Hybrydyzacja kolonijna i łysinkowa. In situ hybrydyzacja. Biblioteki cDNA, genów, makro- i mikromacierzowe. Reprezentatywność bibliotek. Biblioteki genów jako wyjścia do tworzenia kontigów – spacerowanie po chromosomach z wykorzystaniem analizy restrykcyjnej, hybrydyzacji Southerna z sondą-sekwencją powtórzoną, PCR na powtarzającym się DNA, PCR specyficznego dla STS. Identyfikacja DNA kodującego – przeszukiwanie poprawnie dobranej biblioteki cDNA, hybrydyzacja zoo, identyfikacja wysp CpG, poszukiwanie eksonów w komórkach COS. PCR – zasada działania, optymalizacja reakcji. Startery zdegenerowane – zastosowanie do klonowania sekwencji homologicznych DOP PCR. Startery zagnieżdżone. Wielokrotny PCR, odwrócony PCR, LP PCR. Zastosowane PCR do badania polimorfizmu i występowania patogennych mutacji – wykrywanie zmutowanych sekwencji metodami SSCP, CCM, DGGE, PTT. Badanie pokrewieństwa filogenetycznego – RAPD. Sekwencjonowanie. In vitro mutageneza. Badanie ekspresji genów: porównywanie populacji mRNA z różnych warunków - DD PCR, hybrydyzacja northern i RNA dot-blot, hybrydyzacja in situ, RT PCR w tym ilościowy PCR. Badanie sekwencji regulatorowych genów z użyciem genów reporterowych. Analiza delecyjna. Badanie wiązania białek regulatorowych – test opóźnionej migracji w żelu, analiza śladów z życiem DNazy I, test modyfikacji i zakłócenia modyfikacji, metoda southwestern. Badanie ekspresji i funkcji genu na poziomie białek – western, immunowestern, test prezentacji na fagu. Metody identyfikacji i badania oddziaływań białko-białko: ko-immunoprecypitacja, test prezentacji na fagu, drożdżowy system dwuhybrydowy. GMO. Transgenizacja zwierząt – iniekcja/infekcja obcego DNA do zapłodnionych oocytów, iniekcja genetycznie zmodyfikowanych zarodkowych komórek macierzystych do blastocysty. Mutageneza in vivo – gene targeting, genetyczny nokaut. Technologia antysensowna. Tworzenie GMO roślinnych – z udziałem Agrobacetrium tumefaciens lub metodą strzelby genowej. Terapia genowa. Otrzymywanie i zastosowanie komórek macierzystych.
ĆWICZENIA: Hybrydyzacja kwasów nukleinowych. Przygotowanie sondy molekularnej - izolacja fragmentów DNA z żelu, znakowanie metodą random priming. Przenoszenie kwasów nukleinowych na nośniki – metoda Southerna, blot kolonijny. Hybrydyzacja, odpłukiwanie niezwiązanej sondy, wizualizacja wyników hybrydyzacji.
Konstruowanie plazmidu kodującego siRNA – izolacja genomowego DNA nicieni, PCR na genomowym DNA, elektroforetyczna analiza produktów PCR, przygotowanie wektora do klonowania produktów PCR, ligacja produktu PCR do wektora, elektroforeza i izolacja z żelu produktu ligacji.
Otrzymywanie szczepu E. coli powodującego RNAi u Caenorhabditis elegant – ukompetentnianie bakterii DH5α, transformacja bakterii produktami ligacji, identyfikacja klonu niosącego produkt ligacji metodą kolonijnego PCR, elektroforeza produktów kolonijnego PCR, izolacja plazmidu niosącego siRNA, ukompetentnianie i transformacja szczepu karmiącego HT115.
Badanie mechanizmu RNAi. Genotypowanie szczepów nicieni metodą PCR. Wyciszanie genu kolagenu C.elegans poprzez RNAi – hodowla nicieni dzikiego typu na szczepie karmiącym E. coli niosącym siRNA, genotypowanie nicieni poddanych RNAi.